聚丙烯酰胺等电聚焦电泳色谱仪是利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（一种含有各种连续pI的小分子混合物）的电泳分离技术。载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，pI = 3～11。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其混溶其中。
载体两性电解质在溶液中的行为可从两方面看。一方面，溶液的pH决定它带电荷的性质。如溶液pH = 7时，对pI = 9的载体两性电解质来说是处于酸性环境，故带正电荷；但对pI = 3的载体两性电解质来说是处于碱性环境，故带负电荷。所以不同pI的载体两性电解质在同一环境中带有不同性质和数量的电荷。另一方面，溶液中的载体两性电解质又破坏了水的解离平衡，使溶液pH有所改变。当某一载体两性电解质pI较低，即释放质子（H+）能力较强，使溶液pH值下降，这类两性电解质称为酸性载体两性电解质。反之，pI高的可使溶液pH值上升，称为碱性载体两性电解质。
电泳时，凝胶板正极的电极液是磷酸，负极的电极液是氢氧化钠。正极是酸性环境，载体两性电解质都带正电荷，但由于pI不同，其所带正电荷数量有所差异，向负极泳动的速度不同。同理，负极是碱性环境，载体两性电解质带有数量不等的负电荷，以不同速度向正极泳动。根据载体两性电解质的特性，在泳动过程中又不断地与溶液交换质子，改变了溶液的pH。当达到平衡时，即得失质子相等，不再出现质子的交换时，载体两性电解质到达等电点并各处于自己的pI区域，pI即是溶液的pH值。所以溶液呈现不同的pH，随载体两性电解质的pI梯度而形成pH梯度。
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